L'amplificazione del DNA di una classica
PCR ad un certo numero di cicli giunge a plateau, questo solitamente è
indipendente dalla quantità iniziale di templati. Il sistema è
capace di arrivare a plateau per un ampio raggio di DNA di partenza. Grazie
alla PCR quantitativa, ovvero la RT-PCR (Real Time PCR) si può
monitorare la quantità di DNA prima del plateau, durante la fase
esponenziale di crecita, per risalire alla quantità di templato
di partenza.
Il principio è stato quello di aggiungere
ad una normale reazione di PCR un frammento di DNA complementare ad un
tratto della sequenza di interesse, legato covalentemente e 2 molecole
fluorescenti: R (Repoter), un fluorocromo ad elta energia e Q (Quencher),
un fluorocromo a bassa energia. Il quencher ha la funzione di spegnere
la fluorescenza del reporter. Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto
di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q.
Se la sonda è intatta Q spegne la fluorescenza di R perchè
la loro distanza è molto ravvicinata, se invece la sonda è
frammantata la distanza tra Q ed R è maggiore e Q non riesce a
spegnere l'effetto di R, quindi si ha emissione di fluorescenza.
La polimerasi che si utilizza in questa PCR è una polimerasi di
tipo I, alla quale non viene eliminata la sua naturale attività
esonucleasica 5'-3'. Con questa attività è in grado di rompere
un piccolo frammento di DNA che incontra davanti a sè durante la
duplicazione. Siccome la sonda fluorescente che utilizziamo ha un'estremità
5' liberà verrà digerità . La quantità di fluorescenza
emessa è dunque proporzionale alla quantità di templato
presente.
Confrontando la fluorescenza dei campioni rispetto ad uno standard di
riferimento si può risalire al numero di copie di DNA di partenza.
Non è possibile misurare i primi cicli, perchè il segnale
emesso è troppo basso, ma è comunque possibile misurare
la fluorescenza dei cicli all'interno della fase di crescita esponenziale.
Per ogni campione si otterà à un grafico con la sua curva
di crescita, questa curva partirà tanto prima quanto maggiore era
la quantità di templato di partenza.
Lo scopo principale della RT-PCR non è dunque quello dell'amplificazione
del DNA, ma quello della sua quantificazione. Le appicazioni sperimentali
sono moltecipli, per citarne qualcuna: la PCR quantitativa si può
quantificare il DNA virale, è utile per verificare il materiale
dei microarray (come conferma per escludere l'ipotesi di un artefatto
nei geni sovra- o sottoespressi), è utile per misurare danni del
DNA, per l'analisi genotipica, se si utilizzanodue sonde, una per ogni
variante allelica (misurando la fluorescenza si potrà stabilire
se sun soggetto è eterozigote o omozigote per uno dei due alleli).