I microarray permettono di avere sullo
stesso supporto solido numerose sonde. Sono utili per risolvere il fatto
che in ogni cellula c'è il prodotto di decine di migliaia di geni
e che la modificazione di uno solo di essi può riflettersi anche
sull'espressione di numerosi altri.
Molti geni, per loro natura, sono espressi a bassissimi livelli e i loro
messaggeri sono transienti, questo potrebbe rappresentare un problema
anche per gli array.
I chip possono arrivare anche a 100.000 sonde, quindi possono analizzare
un intero trascriptoma. Va tenuto presente che ogni cellula ha un proprio
trascriptoma e questo può variare a seconda del periodo di sviluppo
o in seguito a stimoli esterni. Gli array ci danno un aspetto relativo
del fenomeno, ossia paragonano le condizioni della cellula rispetto ad
un opportuno controllo negativo. Nello stesso microarray si possono infatti
utilizzare due diverse marcature: una per la cellula da staudiare ed una
per il suo controllo.
La produzione degli array č ormai diventata industriale e si puņ scegliere
anche il sottoinsieme di geni che si desidera ai fini dell'l'esperimento,
in questo modo si puņ risparmiare spazio escludendo ciņ che non interessa
e si possono così testare sonde in doppio per una maggiore accuratezza.
La produzione di array può adottare due sistemi: uno chimico, in cui
si procede alla sintesi degli oligonucleotidi e al loro legame covalente con
il supporto, nucleotide alla volta (coperto da brevetto). Oppure esiste un
sistema in cui tramite PCR vengono prodotte tutte le combinazioni oligonucleotidiche
possibili e legate poi alla griglia grazie all'utilizzo di un robot. Ciò
che è fondamentale è che ciascun oligonucleotide sia legato
in un punto ben preciso della griglia, al quale si possa risalire in maniera
univoca una volta eseguita l'analisi.
L'estrazione e la marcatura dell'RNA richiede numerose competenze, sia
di biologia molecolare che di biologia cellulare, inoltre, anche il controllo
negativo deve essere scelto con la massima accuratezza. La marcatura avviene
tramite fluorofori, la radioattività non si può utilizzare
perchè lo spazio di confinamento è troppo ristretto. Esempi
di marcatura sono sequenze poli-A fluorescenti che si ibridano con le
code poli-T caratteristiche dei cDNA ottenuti dagli mRNA. Un altro sistema
di marcatura prevede l'utilizzo di primer con una sequenza che è
identica a quella di promotori forti (es. promotori fagici) e la marcatura
avviene durante la trascrizione, oppure, in una variante di questa tecnica
fa avvenire la marcatura durante la trascrizione inversa.
Controllo e campione vengono ibridati sullo stesso array perchč hanno una
diversa marcatura fluorescente. Sbilanciamenti verso una delle due marcature
indicano una sovraespressione o una repressione di un certo gene rispetto
al controllo. La lettura avviene tramite laser e per ogni "spot"
viene tracciato un cromatogramma dettagliato. L'analisi statistica
del segnale è difficile. Il problrma e: quand'è che una differenza
di espressione ci dice che un gene è represso o sovraespresso? La soluzione
viene data dal punto di vista statistico.
In un recente studio, a fibroblasti in coltura sono stati tolti i nutrimenti
e analizzato il loro trascriptoma ad intervalli di tempo regolari tramite
microarray. Dopo l'analisi sono stati raggruppati alcuni geni in cluster in
base alla loro funzione (Fig.
3). Si è osservato che durante il digiuno, i geni per la biosintesi
del colesterolo vengono repressi, probabilmente perchè si tratta di
una via metabolica che consuma parecchi nutrimenti. I geni del rimodellamento
tessutale vengono invece sovraespressi e le risposte cellulari veloci vengono
spente. Infine, i geni per l'angiogenesi vengono in un primo momento sovraespressi,
poi successivamente ritornano ai valori di espressione di partenza.
I microarray potrebbero venir impiegati per comprendere se veramente gli RNAi
inattivano selettivamente un singolo gene o se questa inattivazione influenza
l'espressione anche di altri geni. Effettivamente si è osservato che
questo tipo di inibizione selettiva di un gene non alterava significativamente
i livelli di espressione di altri geni (dai test statistici, tutte le oscillazioni
di espressione mostravano un valore di p < 0,05).